New Phytologist/一起进化，分开进化：衡量根瘤菌与豆科植物共生与非共生的适宜性
点击蓝字关注我们
题目：Evolving together, evolving apart: measuring the fifitness of rhizobial bacteria in and out of symbiosis with leguminous plants
一起进化，分开进化：衡量根瘤菌与豆科植物共生与非共生的适宜性
期刊：New Phytologist
IF：7.35
作者：Liana T. Burghardt
摘要
由于微生物经历时间和空间的变化选择，大多数植物-微生物的相互作用是兼性的。这种变异是如何影响微生物进化的还不清楚。鉴于豆科植物根瘤菌固氮共生体的可驯化性、生态和农业重要性，它是鉴定细菌适应特性和基因的有力模式。新技术允许在宿主、根际和土壤环境中高通量地测量混合菌剂中细菌突变体、菌株和物种的相对适合度。我考虑了宿主基因变异（GxG）、其他环境因素（GxE）和宿主生命周期变异如何有助于维持根瘤菌的遗传变异和适应性轨迹，以及潜在的其他兼性共生体。最后，我把这些发现放在气候变化中开发有益的接种剂的背景下。
引言
细菌是生命中无处不在的一部分，在植物群落中起着重要的作用，而且常常是有益的。然而，直到最近，在植物上的选择比在细菌上的选择更容易测量。这尤其适用于那些与植物形成兼性联系的细菌，无论它们是否与宿主共存。宿主外部的选择可能是至关重要的，因为在可变环境中的适应度是每个环境的性能和频率。高通量测序允许在复杂的、生态现实的环境中有效地测量细菌适应度，转变对遗传基础和环境中的细菌适应度的认识，并用于估计植物-微生物相互作用模型的参数。
根瘤菌与豆科植物的共生关系长期以来被用于研究生物固氮的功能遗传基础和共生的进化生态学。这种关系对于农业和自然系统中的植物生产力和养分循环至关重要。在自然界，根瘤菌经历了一系列复杂的环境选择。当种子发芽时，共生作用就开始了。当豆科植物根生长时，根瘤菌定植在根的表面，只有一小部分根瘤菌会通过根毛侵入植物组织并引发根瘤的形成。随着根瘤菌的生长，入侵的根瘤菌种群不断扩大，并开始将N2固定到NH3中，以交换包括光合产物在内的资源。这些相互作用的特异性和功能细节（如根瘤菌如何进入根系）差异很大。这些细节在多大程度上影响互惠论本身的演变，是一个活跃的研究领域。不管怎样，对根瘤菌和寄主性状有可测量影响的根瘤菌种群的进化变化可以在少数寄主世代的时间尺度上发生，要么通过谱系频率的变化，要么通过新突变。
图1:豆科植物中的根瘤菌适应性——根瘤菌互惠共生。（a）根瘤菌在自然界所经历的主要环境。N：（NH3）；C：苹果酸（C4H6O5）。（b） 成对接种和更复杂的混合接种实验的例子。（c） 说明根瘤占有率（每个根瘤菌谱系所占的根瘤菌比例）和综合适应度（根瘤菌谱系在所有合并根瘤中的相对代表性）之间的差异。根瘤照片来源：Diana Trujillo
大多数根瘤菌适应试验是用单一菌株进行的。然而，在土壤中，多个根瘤菌属和许多菌株在一个位置共存。在这里，我回顾了测量相对根瘤菌适应度的技术，并概述了我们目前对根瘤菌适应土壤、根际和根瘤的理解。我描述了可变选择的其他来源的影响，包括寄主遗传变异、环境变异和寄主生命周期的变异。了解这种变化是如何影响共生稳定性和细菌进化的，对于预测更大规模的气候变化响应和在保护和农业中利用有益的植物-微生物相互作用至关重要。这些方法学上的进步也为进化生态学家开辟了广泛兴趣的新的研究领域，包括适应多变的环境、表型可塑性和维持遗传变异。
豆科植物与根瘤菌：新工具推动发现
豆科植物-根瘤菌系统为研究植物-微生物的相互作用从识别基因到预测营养循环提供了可操作的模型。一年生二倍体蒺藜苜蓿（苜蓿的近亲）及其共生菌Ensifer meliloti（草木栖剑菌） 是第一对豆科根瘤菌，具有参考基因组和重测序菌株，使全基因组关联研究（GWAS）能够识别基因组变异（如单核苷酸多态性）与感兴趣表型之间的关联。几十年的功能遗传工作为根瘤菌生态学研究结果提供了强有力的基础。例如，宿主DMI和细菌Nod基因对于结瘤的形成很重要，宿主DNF和细菌Nif/Fix基因对于固氮是必要的。在其他豆科植物-根瘤菌系统中，分子和基因组资源的开发正在迅速进行。基因组组合现在可用于超过10种豆科植物和数百种根瘤菌。转录组、代谢组和蛋白质组数据库、基因组修改工具和显微镜技术正在扩大研究范围。
可以理解的是，许多研究都集中在评估实验室培养物中的根瘤菌特性，或者单一菌株与单一宿主一起生长，但是这些分析可能无法测量性状或识别影响菌株混合物适应性的基因。混合接种的相对根瘤菌适合度的测定是一个难题，因为选择后难以区分特定的细菌（物种、菌株和突变体）。以前，这是通过对简单混合物（2-3）进标记基因（如16S-23S RFLP）、荧光标记或抗生素抗性（图1b）。测序技术使扩大到复杂的混合物成为可能：个体突变的适应度效应可以通过插入测序（In -Seq）来分析，也被称为转座子测序（Tn- Seq）；菌株之间的适应度差异可以通过“选择和重排序”（S&R，Box1）；微生物种/属之间的适应度差异可以使用特定标记或核糖体序列进行量化。
与豆科寄主进行大规模混合接种试验的一个局限性是，由于每个结瘤仅由一个或至多由几个谱系建立，结瘤侵染过程本身就造成了一个很强的采样瓶颈。如果混合接种物中有许多可能的结瘤定殖者，则需要对成百上千个结瘤取样以克服随机过程，但如果只有两三个可能的结瘤定殖者，则需要取样的结节要少得多。研究人员以两种互补的方式分析混合接种在宿主体内的结果。大多数早期的混合接种实验都是对每个结瘤分别进行检测，以确定每个接种体成员形成结瘤的比例（即结瘤占有率）。相比之下，在根瘤菌鉴定之前汇集来自植物的所有根瘤菌提供了一种综合的适合度测量，包括哪些根瘤菌形成根瘤以及根瘤菌种群大小在根瘤内部和根瘤外的差异（较大的根瘤菌通常较多；图1c）。因此，共池法可用于鉴定影响相对根瘤菌适应度（Box1）复合性状的基因和基因功能。当结合每个菌株为宿主提供的个体益处的数据时，混合接种的实验可以评估宿主是否增加了对它们有利的菌株的适应度，反之亦然。在不同的环境中有效地测量物种之间适应度的能力有可能极大地提高我们对互惠进化的理解。
Box1使用“选择和重排序”来识别根瘤菌适应
度的关键性状和基因
苜蓿剑菌系统（也称为中华根瘤菌）特别适合于鉴定根瘤菌适应度的基因组基础。其中一个原因是苜蓿几乎完全与两种剑菌的一个谱系相关联，允许开发和使用宿主和微生物的全基因组关联研究（GWAS）
苜蓿剑菌系统工具与共生细节
| 苜蓿品种 | 遗传模型：截形苜蓿（蒺藜苜蓿） 牧草/盖被作物：紫花苜蓿、天蓝苜蓿、多形苜蓿 |
寄主生命周期 | 主要是冬季和多年生，一些是两年生和夏季生 |
根瘤菌属 | 剑菌属（所有宿主），新根瘤菌属（3种宿主），根瘤菌属（1种宿主） |
共生类型 | 根毛感染，不定结瘤，共生体，终末分化 |
模型系统工具 | 两者：多个基因组组合，表达图谱，转化 苜蓿：Tnt-1、EMS和FNB突变库、RILs、HapMap-GWAS面板 剑菌：Tn-5文库，>700剑菌重排序，代谢模型 |
选择和重排序（S&R）实验：Burghardt等人（PNAS/Select and resequence reveals relative fifitness of bacteria in symbiotic and free-living environments.）通过从两种宿主基因型的根瘤中提取DNA，并将基于最大相似性的单倍型重建方法应用于高覆盖率、全基因组核苷酸多态性频率，测量101株细菌的相对菌株适应度。他们发现不同寄主基因型之间的菌株适应度之间存在弱的正相关关系，这表明在密切相关的寄主材料的模块内菌株适应度的部分共享遗传基础。
用GWAS鉴定结瘤中细菌适合性的基因组基础：Burghardt等人2018年发现宿主中的细菌适应度与涉及细菌运动、宿主识别和固氮的基因变异相关。虽然这些变异中的一些与其他基因的变异紧密相连，但有益菌的GWAS是比较容易验证候选基因的。
适应度比对的基因组基础：一个宿主基因型（A17）与比另一个更有益的细菌菌株相关。Epstein等人通过寻找单个菌株接种中植物大小和菌株适应度的最佳候选GWAS之间的重叠确定了可能影响这两个性状的细菌基因，包括NifA和QueC。
前进方向：应将S&R研究扩展到多代，额外的生态环境和基于年龄、形态，功能的结瘤样本的各种群落复杂性。
相关测定问题：土壤、根际和寄主植物中根瘤菌的选择
根瘤菌经常在豆科植物互惠共生的背景下进行研究，但每一个谱系也将作为自由生活的细菌存在于土壤和根际（图1a）。这种兼性生活方式意味着根瘤菌系暴露在时间和空间变化的环境中。研究人员开始使用之前概述的混合接种技术，将这种变异纳入我们对根瘤菌自然选择的理解中。
在不同豆科植物寄主上进行的混合接种试验表明，绝大多数根瘤菌被一个单一的根瘤菌谱系占据（或至少占优势）。然而，在温室和实验室实验中，共感染率超过10%，共感染率随着接种密度的增加而增加。单一菌株分析的菌株适应性指标（例如根瘤数）很少能预测混合接种试验中的根瘤菌占有率，而工业接种菌株往往比农业用根瘤菌更具竞争力（Box2）。通过删除与生物膜形成和运动有关的基因，改变影响生长期的rRNA操作的拷贝数，以及修改质粒的存在，可以改变结瘤的占有率。
Box2农业应用
豆科植物被用于提高土壤肥力已有数千年，并为人类的利益积极管理了一个多世纪，但是农业中的生物固氮率在不同年份和不同领域中仍然不一致，生态和无公害肥料可应用于许多豆类作物，以使产量最大化。目前，人们对开发新的微生物菌剂以提高作物产量和抗逆能力以及管理病虫害有着浓厚的兴趣和投资。自然系统和农业系统的一个显著区别是，一个作物品种单独种植，一个不允许播种，因此，作物不能与土壤中的根瘤菌共同侵染。维持互利关系要求菜豆具有较高的适应性，但豆科育种往往以植物效益为主，而不是以根瘤菌效益为主。下面，我强调如何更好地理解农业系统中根瘤菌适应性的生态和进化驱动因素，有助于克服大规模部署根瘤菌所带来的挑战。
未能建立：将菌株接种到田间，而不是将其高密度接种到具有单基因型植物性状的田间。一条前进的道路是确定哪些细菌特性影响不同土壤类型（而不是培养）的细菌适应度。
竞争问题：土壤中的本地细菌菌株在与宿主的联系方面超过接种菌株。一个前进的方向是确定哪些基因是形成结瘤的菌株竞争的基础。
互惠分解：随着时间的推移，农业领域的菌株变得不那么有益。一条前进的道路是找到影响生物体适应度和植物繁殖的基因，特别是增加有益细菌的适应度（即适应度校准）。
在土壤和根际环境中进行的混合接种试验很少。对根际的研究揭示了细菌传播和附着在根表面上的重要作用——包括群体感应、生物膜、胞外多糖、趋化性和运动性。在一项大规模的宏基因组研究中，Levy等人发现与生活在其他环境中的细菌相比，这些相同的基因和基因功能中有许多在植物相关细菌中富集。操纵性混合接种土壤试验为确认培养环境的结果提供了一条途径，同时建立和测试新的假设。
经历多个环境的微生物谱系的累积是每个环境（如宿主和土壤）适合度的产物，但大多数混合接种试验是在单个环境中进行的。同时评估根瘤、根际和土壤的适宜性将决定不同环境中适宜性相关性的大小和范围。例如，Burghardt发现寄主和土壤环境之间的应变适应度相关性非常弱，但在土壤和培养适应度之间存在很强的权衡。跨环境适应度相关性的强度和方向性（正或负）对农业的适应性和接种发展具有重要影响（Box2）。与每个环境中根瘤菌种群大小的测量一起，相对适宜度的测量提供了对根瘤菌选择压力的全面见解。
宿主遗传变异与环境变异的选择
由于寄主身份、资源利用率、温度、湿度和更大的生物群落的变化，根瘤菌也经历了时间可变的选择。寄主的种间和种内遗传变异都会影响根瘤菌的选择，并会导致混合接种试验中的目级移动。如果豆科植物物种或基因型同时出现，那么宿主特异性适合度可以促进多个根瘤菌菌株的共存。即使是单个宿主基因的变异也会对根瘤菌的占有率和根瘤的频率产生显著影响。这些效应通常取决于根瘤菌的谱系，可能是单个根瘤菌基因遗传变异的结果。
根瘤菌对植物生长具有主要的积极影响，但这种影响的强度取决于环境因素，例如氮的有效性。不太清楚根瘤菌的适应性在多大程度上取决于环境因素。混合接种试验的新模式表明，营养物质、水和温度可对争夺根瘤占有率和适宜度的结果产生可测量的影响，但与宿主变异的影响相比，这些影响相对较小。要全面了解应变适应度、植物适应度和固氮量是如何随气候和土地利用变化而变化的，需要进行横跨豆科植物系统的综合试验。未来的研究应检查其他直接和间接的生物参与者，如噬菌体、其他竞争细菌、丛枝菌根真菌、线虫和草食动物如何改变根瘤菌和豆科植物之间的相互作用。这种系统级的方法将允许对特定群落成员的相互作用进行功能描述，并促进对微生物自然史的理解。
豆科植物生命周期变异的选择
图2注:寄主和土壤为根瘤菌创造的环境变化示意图。土壤环境中多种菌株共存。箭头的大小大致反映了根瘤菌的数量，这些根瘤菌从土壤转移到宿主的根瘤中，然后在根瘤菌衰老时又回到土壤中。示意图表示自然种群和农业环境（不同豆类作物或品种）的变化。问号表明结瘤形成和衰老的时间模式的不确定性，特别是多年生豆科植物。为简单起见，省略了根际环境和两年生生命周期。
尽管直接影响寄主内根瘤菌的基因已经引起了大多数人的注意，但其他植物性状可以深刻地改变对根瘤菌的选择（图2）。例如，植物生命周期的长度和时间的变化改变了细菌暴露于宿主选择之外的时间。这些生命周期的变化也改变了结瘤形成和细菌释放的时间，这是自然和农业环境中未被研究的过程。例如，形成长寿根瘤的多年生寄主比形成新根瘤并每年将根瘤菌释放回土壤的寄主创造了更稳定的选择机制（图2c）。与自然系统不同，豆科植物在农业系统中出现的时间和频率取决于诸如种植时间、作物轮作和覆盖种植等管理做法（Box2）。一些实验性进化研究已经检测了暴露于多代宿主后的细菌适应。这样的操作方法可以用来解决宿主生命周期对根瘤菌进化的影响问题。
豆科植物在生命周期中表现出广泛的变化。生命周期表达的变化可能是暴露于环境变化（如气候变化）或关键转变（如萌发或开花）的遗传变化的结果。令人兴奋的是，拟南芥开花时间和多年生性的许多基因可作为豆科植物开花时间变化的基础。展望未来，开花期基因突变的豆科植物将有助于研究固氮基因网络如何与环境敏感的开花期途径和更普遍的地上过程相结合。
结论
我认为理解和利用豆科植物根瘤菌共生需要一种明确的进化方法,广泛应用于其它兼性植物的微生物-既致病又有益。复杂混合菌剂中细菌谱系追踪的方法学进展可应用于其他宿主-微生物系统，包括植物病原体，鱿鱼发光细菌与人类肠道微生物组。豆科植物根瘤菌研究的最新进展也可以作为一个模型，更广泛地理解参与兼性共生的微生物的进化和生态学。对兼性关系的明确建模将允许预测自然界中的互利相互作用将如何应对环境变化（例如气候变化）。同样，寄主生命周期在塑造细菌选择中所起的作用也将不限于互惠论者或植物。追求这些研究路线，提高了从基因和功能特征到生态系统级养分循环的可能性，这与最大限度地提高农田产量和养分保持率有关。总之，以一个明确的生态和进化观点，结合细菌所经历的环境的真实变化，提供了一个新的视角来看待我们这个时代的关键环境和农业挑战。
扫码关注我们
点击阅读原文可下载原文